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jueves, 20 de octubre de 2011

Hemoglobina: una molécula modelo para el investigador

Hemoglobina: una molécula modelo para el investigador
Oscar Andrés Peñuela, M.D.*
RESUMEN
Se presenta la revisión general sobre la hemoglobina, una de las proteínas más estudiadas y mejor caracterizadas. La gran
variedad de aspectos científicos que incluye y la importancia que juega en la biología hace que, aunque los primeros estudios
científicos se hayan realizado desde el siglo XIX, aún hoy aparezcan sorprendentes descubrimientos acerca de esta molécula, tales
como las nuevas globinas, neuroglobina y citoglobina y las llamativas interacciones con el óxido nítrico. Asimismo, el estudio de
las hemoglobinopatías constituye un gran reto para la medicina moderna en la medida en que ponga al servicio de sus pacientes
los resultados de la investigación científica básica.
Palabras clave: Hemoglobina; Transporte de gases; Evolución; Óxido nítrico.
Hemoglobin: a model molecule for research
SUMMARY
This paper has the objective to review hemoglobin, one of the most studied and characterized proteins. Hemoglobin is a very
important protein in biology. Although the first papers were written in 19th century, today a lot of amazing discoveries are shown,
like new globins neuroglobin and cytoglobin and, nitric oxide interactions. In addition, hemoglobinopathies are a medicine’s
challenge for applying basic research to the patient’s attendance.
Key words: Hemoglobin; Blood gas transportation; Evolution; Nitric oxide.
* Estudiante Maestría en Fisiología, División de Fisiología, División de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional
de Colombia, Bogotá, Colombia. e-mail: oapenuelab@unal.edu.co
Recibido para publicación agosto 3, 2004 Aprobado para publicación junio 27, 2005
Uno de los ejemplos más llamativos de la relevancia del
proceso evolutivo y la eficiencia de los sistemas biológicos se
encuentra en los eritrocitos. Una de sus funciones vitales es
su participación en el intercambio gaseoso de oxígeno y
dióxido de carbono entre los pulmones y los tejidos. La hemoglobina
(Hb), es el componente fundamental de este proceso1.
Las hemoglobinas son proteínas globulares, presentes en
los hematíes en altas concentraciones, que fijan oxígeno en los
pulmones y lo transportan por la sangre hacia los tejidos y
células que rodean el lecho capilar del sistema vascular. Al
volver a los pulmones, desde la red de capilares, la hemoglobina
actúa como transportador de CO2 y de protones2.
La hemoglobina ha jugado un papel histórico en la química,
la biología y la medicina. En 1849 se convirtió en la primera
proteína en ser cristalizada y asociada con una función fisiológica
específica. La diferencia morfológica entre los cristales
de hemoglobina de diferentes organismos proporcionó por
primera vez evidencia contundente acerca de la especificidad
en la expresión proteica entre las especies. Además, se
encuentra entre las primeras proteínas cuyo peso molecular
fue determinado correctamente. En 1958 se convirtió en la
primera proteína eucariota en ser sintetizada in vitro, trabajo
que permitió comprobar que el mecanismo de síntesis proteica
en eucariotas es similar al de Escherichia coli. Su estructura
se estableció en 19603. El ARN mensajero de la globina fue
el primer mensajero eucariota en ser aislado4 y en tener una
secuencia nucleótida determinada5.
El descubrimiento de que la anemia de células falciformes
es causada por el reemplazo de uno sólo de los 287 residuos
de aminoácidos, presentó por primera vez indicios de que una
mutación puntual en un gen estructural puede causar la sustitución
de un aminoácido en la proteína codificada por este gen
y causar enfermedad6. De otro lado, el estudio de la hemoglobina
abrió campo al desarrollo de nuevos y sofisticados
métodos físicos y el establecimiento de importantes teorías
sobre cooperatividad y alosterismo7. De igual forma, la transición
de la síntesis de hemoglobina desde la vida fetal a la adulta
es un gran ejemplo de diferenciación celular8.
El estudio de las hemoglobinas anormales ha permitido
claramente conocer la estrecha relación entre los errores
genéticos, los defectos proteicos y las manifestaciones clíni-
© 2005 Corporación Editora Médica del Valle Colomb Med 2005; 36: 215-225
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cas que produce. Finalmente, la distribución de ciertas
hemoglobinas anormales como la HbS en regiones específicas
endémicas de malaria, ilustra claramente los mecanismos
naturales de la evolución y adaptación antropológica
(polimorfismo balanceado).
GENÉTICA Y SÍNTESIS DE HEMOGLOBINA
La biosíntesis de la Hb guarda estrecha relación con la
eritropoyesis. La expresión genética y el contenido de Hb
acompañan la diferenciación de las unidades formadoras de
colonias eritroides (UFC-E) en precursores eritroides. Cada
una de las cadenas polipeptídicas de la Hb cuenta con genes
propios: α, β, δ, γ, ε. Los genes α y β son independientes y
se ubican en cromosomas distintos. El grupo α se localiza en
el brazo corto del cromosoma 16 y contiene además los
codificadores de la cadena z. El grupo β se localiza en el brazo
corto del cromosoma 11 e incluye a los genes de las cadenas
Gγ, Aγ, δ y ε. Todos los genes funcionales de la globina
comparten una estructura general que consiste en 3 exones
(secuencias codificadoras) y 2 intrones o sectores interpuestos
(secuencias que no se traducen). La región promotora
incluye alrededor de 100 pares de bases que preceden al
punto de comienzo de la transcripción (punto de clivaje). Tres
secuencias de esta región se fijan a la ARN polimerasa que
cataliza la síntesis de ARN mensajero. Existen dos secuencias
claves en la iniciación de la transcripción: TATA y CAT;
las mutaciones que las afectan limitan la transcripción de
ARNm. La porción distal del tercer exón (AATAAA)
finaliza la transcripción. Solamente entre 5% a 10% del
material genético de los eritroblastos se transcribe; los genes
de la globina pertenecen a esta fracción1.
La síntesis de ARN se lleva a cabo bajo la influencia de
grupos enzimáticos denominados ARN polimerasas. La
transcripción primaria del ARNm incluye copias de toda la
secuencia del ADN genómico (intrones y exones). Antes de
su transporte al citoplasma se procesa por clivaje del extremo
5’, hay separación de las secuencias transcriptas de los
intrones y poliadenilación del extremo 3’. Este último paso es
esencial en el transporte y estabilización citoplasmática del
ARNm. La separación implica la formación de asas en el pre-
ARNm, de manera que los extremos distales de los exones
(puntos dadores) se acerquen a los proximales de los subsiguientes
exones (puntos receptores). Luego, los intrones
sufren clivaje enzimático y los puntos dadores y receptores se
sellan. Los puntos de consenso son secuencias de nucleótidos
adyacentes que perfeccionan la síntesis del ARNm. Las
mutaciones que involucran tanto los puntos de unión, así como
los de consenso, alteran la separación y crean ARNm
anormales.
La causa más común de las hemoglobinopatías es la
mutación puntual, es decir, la sustitución de un nucleótido de
ADN por otro, lo que modifica el código genético y puede
inducir un cambio en un aminoácido de la globina resultante.
Por ejemplo, la anemia de células falciformes (HbS), donde
el ácido glutámico se reemplaza por una valina en el aminoácido
6, que ocupa el tercer lugar del helicoide A de la cadena β: β6
(A3) Glu Val1.
La traducción es un proceso ribosómico en donde se
sintetiza una cadena polipeptídica de acuerdo con un patrón
proporcionado por la secuencia de codones del ARNm.
Incluye cuatro etapas: activación, en la que se forma el ARN
de transferencia (ARNt); iniciación, cuando el ARNt que
contiene metionina, se alinea con el codón iniciador AUG en
el ARNm del ribosoma; elongación, donde cada anticodón del
ARNt se adosa a cada codón del ARNm. Los aminoácidos
del ARNt se adosan mediante un puente peptídico a otro
aminoácido ya unido al ribosoma. Finalmente, la terminación
se produce cuando se llega a un codón de finalización UAA,
la cadena polipeptídica se completa y se separa del ribosoma.
Los polipéptidos libres forman de inmediato dímeros αβ y
tetrámeros α2β2.
La maduración de proeritroblastos a eritrocitos está controlada
positivamente por la hormona polipeptídica
eritropoyetina, que promueve tanto la proliferación como la
sobrevida de los precursores eritroides. También, sobre la
superficie de dichos precursores, se encuentran unos receptores
que promueven la apoptosis y que son estimulados por
enzimas denominadas caspasas. La activación de estos
receptores (o la deprivación de eritropoyetina) conduce al
clivaje, por parte de las caspasas, de una proteína regulatoria
nuclear llamada GATA-1, indispensable para el proceso
eritropoyético, lo que conduce a apoptosis y detención de la
maduración. Los receptores de «muerte celular» se han
denominado sistema Fas/FasL10.
La constante investigación acerca de los genes sobres los
cuales actúa el factor de transcripción genético GATA-1
condujo al descubrimiento de un gen expresado en altos
niveles en el eritroblasto, que codifica una proteína chaperona
denominada AHSP (proteína estabilizante de cadena alfa) la
cual se une específicamente a las cadenas α, y cuyo papel
está relacionado con la estabilización de dichas cadenas,
evitando que se precipiten formando inclusiones citoplasmáticas
(cuerpos de Heinz) que afectan a la membrana
>
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celular y conducen a la lisis eritrocitaria11.
El grupo hem se sintetiza en virtualmente todos los tejidos,
pero su síntesis es más pronunciada en la médula ósea y el
hígado, debido a la necesidad de incorporarlo en la Hb y los
citocromos, respectivamente. Es una molécula plana que
consta de un hierro ferroso y un anillo tetrapirrólico, la
protoporfirina IX. Característicamente demuestra una banda
a 440 nm o de Soret y otras cuatro más en el espectro visible
(Gráfica 1). El hem es un factor fundamental en la regulación
de la tasa de síntesis de la globina12. Su principal efecto se
ejerce en la iniciación de la traducción, donde bloquea la
acción de un inhibidor de la producción de globina13. También
participa en la transcripción y el procesamiento del ARNm.
Su papel en la síntesis proteica en los mamíferos se extiende
más allá del eritrocito; en el tejido hepático y cerebral se
demuestran sustancias que dependen del hem para comenzar
la producción de proteínas14.
Normalmente los eritrocitos envejecidos se degradan
hacia el día 120 de vida en la médula ósea, el hígado y el bazo.
En algunas circunstancias sin embargo, los eritocitos sufren
lisis intravascular, liberando Hb, que puede ser tóxica para los
tejidos a menos que se remueva rápidamente. La haptoglobina
(Hp) es una proteína plasmática que une Hb libre, a través de
la formación de un complejo Hp-Hb. Este complejo es
reconocido a través de una proteína situada en la superficie
de los macrófagos y monocitos denominada CD163, permitiendo
su digestión y la seguida liberación de hierro y bilirrubina.
La expresión de Hp y CD163 está regulada por proteínas de
fase aguda como la interleucina 6 (IL-6) sugiriendo que las
enfermedades inflamatorias crónicas se relacionan con alteraciones
del metabolismo del hierro15.
ESTRUCTURA DE LA H
Las cuatro cadenas polipeptídicas de la Hb contienen
cada una un grupo prostético hem. Un grupo prostético es la
porción no polipeptídica de una proteína. El hem es una
molécula de porfirina que contiene un átomo de hierro en su
centro. El tipo de porfirina de la Hb es la protoporfirina IX;
contiene dos grupos ácidos propiónicos, dos vinilos y cuatro
metilos como cadenas laterales unidas a los anillos pirrólicos
de la estructura de la porfirina. El átomo de hierro se
encuentra en estado de oxidación ferroso (+2) y puede formar
cinco o seis enlaces de coordinación dependiendo de la unión
del O2 (u otro ligando) a la Hb (oxiHb, desoxiHb). Cuatro de
estos enlaces se producen con los nitrógenos pirrólicos de la
porfirina en un plano horizontal. El quinto enlace de coordinación
se realiza con el nitrógeno del imidazol de una histidina
denominada histidina proximal. Finalmente, el sexto enlace
del átomo ferroso es con el O2, que además está unido a un
segundo imidazol de una histidina denominada histidina distal.
Tanto el quinto como el sexto enlace se encuentran en un
plano perpendicular al plano del anillo de porfirina (Figura 1).
Las cadenas polipeptídicas a contienen 141 aminoácidos,
las no α 146 (β, γ, δ) y difieren en la secuencia de aminoácidos.
Se conoce desde hace décadas la estructura primaria de las
cuatro cadenas de Hb normales16. La estructura secundaria
es muy similar: cada una exhibe 8 segmentos helicoidales
b
Gráfica 1. Caracterización espectrofotométrica de la Hb
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
210
230
250
270
290
310
330
350
370
390
410
430
450
470
490
510
530
550
570
590
610
Longitud de onda (nm)
Absorbancia
Acidos nucleicos residuales
AMINOACIDOS
AROMATICOS (Try)
Grupo Hem (Banda de Soret)
HbO2
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designados con las letras A a la H. Entre ellos se encuentran
7 segmentos no helicoidales: NA, AB, CD, EF, FG, GH Y
HC. Esta distinción es fundamental pues los segmentos
helicoides son rígidos y lineales, mientras que los no helicoidales
son flexibles. Como el hierro del hem forma un puente
covalente con la histidina proximal (F8) y el O2 se une de
forma covalente al hem y a la histidina distal (E7), el hem
queda suspendido en una hendidura no polar entre los helicoides
E y F (Figura 2).
La difracción de rayos X de alta resolución permitió
conocer la naturaleza de los contactos intercatenarios de la
Figura 2. Estructura tridimensional de la hemoglobina
Figura 1. Estructura del grupo hem
Hb. Los que se establecen entre cadenas semejantes, es
decir, α1α2 y β1β2 son limitados y de escasa importancia.
Los principales contactos son α1β1 y α1β2 que determinan
dos estructuras cuaternarias: una para la oxiHb y otra para la
desoxiHb17.
La parte porfirínica del hem se sitúa dentro de una bolsa
hidrofóbica que se forma en cada una de las cadenas polipeptídicas.
Las estructuras obtenidas por difracción de rayos
X muestran que en la bolsa del hem existen unas 80
interacciones entre 18 aminoácidos y el hem. La mayoría de
estas interacciones no covalentes se presentan entre cadenas
apolares de aminoácidos y las regiones no polares de la
porfirina.
TRANSPORTE DE O2 Y CO2
La sangre necesita de un transportador de O2 porque este
gas no es suficientemente soluble en el plasma sanguíneo para
satisfacer las necesidades corporales. A 37ºC, un litro de
sangre sólo disuelve 2.3 ml de O2. Sin embargo, un litro de
sangre contiene 150 g de Hb, y como cada gramo de Hb
disuelve 1.34 ml de O2, en total se transportan 200 ml de O2
por litro de sangre. Esto es, 87 veces más de lo que el plasma
solo podría transportar. Sin un transportador de O2 como la
Hb, la sangre tendría que circular 87 veces más rápido, lo que
precisaría una bomba de alta presión, un flujo turbulento y un
enorme desacople ventilación-perfusión.
La relación entre la tensión de O2 y la saturación de la Hb
se describe mediante la curva de saturación de la oxiHb. La
afinidad de la Hb por el O2 se expresa en términos de la tensión
de O2 en que se produce una saturación de 50% de la Hb
(P50). Este valor corresponde a 27 mm Hg
aproximadamente. De forma parecida a las
enzimas, una P50 alta corresponde a una afinidad
por el O2 baja.
La curva de disociación de la oxiHb de los
polipéptidos con una sola unidad hem, como la
mioglobina es hiperbólica. Así, su afinidad por
el O2 es mayor que la de la Hb, liberando O2
solamente a muy bajas tensiones tisulares. Por
el contrario, la curva de disociación de la
hemoglobina es sigmoidea. De esta forma, la
Hb está saturada 98% en los pulmones y sólo
33% en los tejidos, de manera que cede casi
70% de todo el O2 que puede transportar. La
porción más empinada de la curva se encuentra
en las zonas de baja tensión de O2 de los tejidos,
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lo que significa que disminuciones relativamente pequeñas en
la tensión de O2 dan lugar a grandes incrementos en la cesión
de O2. Sin embargo, pequeñas disminuciones en la tensión de
O2 en los pulmones (altitud moderada) no comprometen
seriamente la capacidad de la Hb para fijar O2. Adicionalmente,
la curva revela que a bajas tensiones de O2, la fijación de O2
es relativamente débil (menor afinidad), mientras que a altas
tensiones la fijación es fuerte (mayor afinidad). Lo anterior
refleja el mecanismo de cooperatividad de la Hb, por el cual
la ligadura del O2 a una subunidad eleva la afinidad de las otras
subunidades18.
La afinidad de la Hb por el O2 está influida por una serie
de variables que incluyen la concentración de protones, el
CO2, la temperatura y el 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG)19. La
concentración del ión hidrógeno influye sobre la afinidad de la
Hb por el O2. El pH bajo desplaza la curva hacia la derecha,
facilitando la cesión de O2, mientras que el pH elevado la
desplaza hacia la izquierda. Esta modificación se conoce
como efecto Bohr y se representa por la ecuación:
HHb + O2 HbO2 + H+;
y demuestra que la oxigenación de la Hb aumenta la acidez,
o dicho de otra manera, la desoxigenación de la Hb aumenta
la basicidad.
La temperatura tiene también un efecto importante sobre
la afinidad de la Hb por el O2. A temperaturas por debajo de
la normal, la fijación es más fuerte, desplazando la curva a la
izquierda; a temperaturas elevadas la fijación se hace débil y
la curva se desplaza a la derecha.
La hemoglobina muestra además un efecto heterotrópico
de gran significación biológica. Esto implica su interacción
con el 2,3-DPG, el compuesto fosforilado predominante en el
eritrocito20. El 2,3-DPG funciona como un efector alostérico
para la Hb. En la conformación desoxi (estructura cuaternaria
T, «tensa») existe una cavidad suficientemente grande para
admitir al 2,3-DPG entre las cadenas β. Además, esta
cavidad está cargada positivamente, fijando así una molécula
de 2,3-DPG de carga negativa. Cuando la Hb se oxigena,
asume una configuración cuaternaria R, «relajada». Los
fenómenos moleculares de este cambio no se han establecido
totalmente, pero al parecer implica una configuración intermedia
entre R y T. La conversión final a R se inicia con la
fijación de una molécula de O2 a la interacción α1β2 y se
continúa con la eliminación del 2,3-DPG y la disrupción de los
puentes salinos e interacciones hidrófobas en el contacto
α1β2 formados en T21. Las variaciones de la concentración
del 2,3-DPG desempeñan un papel fundamental en la adaptación
a la hipoxia, de manera que en la hipoxemia aumenta
el 2,3-DPG eritrocitario, la afinidad por el oxígeno declina y el
aporte a los tejidos se facilita22.
El transporte eritrocitario de CO2, a diferencia del transporte
de O2, no se realiza por unión directa al hem, sino que
se relaciona estrechamente con el mantenimiento del pH
sanguíneo. El CO2 difunde libremente en los eritrocitos, donde
la anhidrasa carbónica cataliza la reacción
CO2 + H2O H2CO3
La posterior ionización del H2CO3 en H+ y HCO3- es una
reacción rápida y espontánea que genera cantidades equivalentes
de H+ y de HCO3-. El H+ generado se incorpora a la
desoxiHb, proceso facilitado por el efecto Bohr. El bicarbonato
por su parte, difunde a través de la membrana eritrocitaria
y en parte se intercambia con iones Cl- del plasma, mecanismo
denominado desplazamiento del cloruro. Así se transporta
la mayoría del CO2. El restante, se transporta como CO2
disuelto (5%) y como carbaminohemoglobina (15%), producto
de la reacción del CO2 con los grupos amino de la Hb, donde
se generan entre 1 y 2 equivalentes de H+. La desoxiHb
forma compuestos carbamino más rápido que la oxiHb; la
oxigenación produce liberación del CO2 fijado. La curva de
disociación del CO2 es más lineal que la del O2, sobre todo en
el rango fisiológico 40-60 mm Hg. La desoxiHb tiene mayor
afinidad por el CO2 a causa del efecto Bohr. El desplazamiento
de la curva (efecto Haldane) favorece la fijación de CO2
en los tejidos y su liberación en los pulmones.
La Hb además de transportar O2 y CO2, juega también un
papel fundamental en la regulación del pH sanguíneo. Esto se
realiza por medio de dos mecanismos. El primero se debe a
los grupos ionizables de la Hb (imidazoles de las 38 histidinas
por tetrámero), que junto con los fosfatos orgánicos de los
eritrocitos y las proteínas plasmáticas suman 60% del amortiguamiento
sanguíneo. El resto del ácido que se produce a
partir del transporte de CO2 (40%) es absorbido por la Hb a
través del transporte isohídrico de CO2, que corresponde al
segundo mecanismo y se basa en la capacidad de la Hb para
captar H+ sin cambio en el pH.
HEMOGLOBINA NORMAL Y SUS VARIANTES
Para operar como vehículo de intercambio gaseoso, la
hemoglobina (Hb) debe satisfacer ciertos requerimientos
básicos como son: ser capaz de transportar cantidades
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Colombia Médica Vol. 36 Nº 3, 2005 (Julio-Septiembre)
considerables de oxígeno; ser muy soluble; captar y descartar
oxígeno a presiones apropiadas y, ser un buen amortiguador.
Más del 95% de la hemoglobina del adulto y de los niños
mayores de 7 meses es A (HbA). Su estructura se designa
como α2β2, para indicar que posee dos cadenas α y dos β.
Los adultos normales también tienen un 2-3% de HbA2, la
cual está compuesta por dos cadenas α como las de la Hb A,
y dos cadenas δ. Se representa como α2δ2. Las cadenas δ
son diferentes de las cadenas β y están bajo control genético
independiente. Normalmente también existen diversas especies
de HbA modificada; se designan como A1a1, A1a2, A1b
y A1c, y se deben a modificaciones postraduccionales de la
Hb con diversos azúcares como glucosa-6-fosfato. La más
importante cuantitativamente es la Hb A1c. Proviene de la
fijación covalente de un resto de la glucosa al extremo Nterminal
de la cadena β. La reacción no es catalizada
enzimáticamente, dependiendo entonces su velocidad de la
concentración de glucosa. Por tanto, la Hb A1c constituye
una medida útil del control de los pacientes diabéticos durante
los días o semanas previos a la toma de la muestra.
La Hb fetal (HbF), es el componente principal de la Hb del
recién nacido. Posee dos cadenas γ en lugar de dos cadenas
β y se representa α2γ2. La HbF está adaptada al ambiente
materno-fetal. Ha de fijar el oxígeno mucho más fuerte para
competir por el O2 con la HbA materna (su curva de
saturación está desplazada a la izquierda). Esto se consigue
gracias a que dos de los grupos que recubren la cavidad de
fijación de 2,3-difosfoglicerato (DPG) tienen cadenas laterales
neutras, a diferencia de la HbA en la que están cargadas
positivamente. Lo anterior hace que el DPG, cargado negativamente,
se una menos a la HbF y en lugar de ello, se fije más
fuerte el O2. Además, entre 15% y 20% de la HbF está
acetilada en sus N-terminales y se denomina HbF1; esta
variante no fija DPG1 (Cuadro 1).
Las hemoglobinas Gower I, Gower II y Portland son
embrionarias y sólo aparecen durante el primer trimestre de
gestación24. La Hb Gower II es la más importante y alcanza
entre 50% y 60% de toda la Hb embrionaria. Al parecer las
cadenas polipeptídicas epsilon (ε) y zeta (z) se sintetizan en
el saco vitelino. Las cadenas β, ε, γ, δ están codificadas por
un gen del cromosoma 11; las z y α por un gen del extremo
5’ del cromosoma 16.
EVOLUCIÓN NATURAL
Las hemoglobinas están presentes en todos los reinos de
la naturaleza con particulares especializaciones de acuerdo
con las necesidades de cada organismo. Se pueden sintetizar
grandes cantidades de hemoglobina en células especializadas,
como los eritrocitos, cuando es necesario transportar
eficientemente O2 a sitios especiales de intensa actividad
respiratoria. También se generan cantidades pequeñas de
proteínas como la mioglobina y la hemoglobina no simbiótica
de las plantas cuando es necesario un rápido sistema
intracelular de liberación de O2, como en la mitocondria o el
cloroplasto24. Cuando el sistema de transporte de electrones
no está separado del compartimiento intracelular, como en las
bacterias, las hemoglobinas pueden ser usadas, bajo condiciones
hipóxicas, para liberar oxígeno como aceptor terminal de
electrones. Por tanto, existe una conexión evolutiva entre las
hemoglobinas que transportan O2, los citocromos que pasan
electrones a través de la cadena respiratoria y la fotosíntesis,
y las demás hemoproteínas que catalizan reacciones redox.
Quizá 1.800 millones de años atrás los anillos de porfirina
unidos a un metal evolucionaron junto con la fotosíntesis y la
consiguiente aparición del O2 en la atmósfera, a partir de un
gen ancestral común (Figura 3).
Pronto en la evolución se incorporó la utilidad de los anillos
de porfirina unidos a un metal para la transferencia de
electrones. Tal es el caso de los citocromos que transportan
electrones en la cadena respiratoria, u otras hemoproteínas
que catalizan una clase variada de reacciones de óxidoreducción.
Aun en la fotosíntesis, los anillos de porfirina
transportan los electrones generados a partir de la luz solar y
el agua para luego generar ATP. Otras hemoproteínas se han
adaptado para unir reversiblemente el oxígeno generado en la
fotosíntesis y transportarlo a cada célula de todos los grupos
de organismos: procariotas, hongos, plantas y animales24,25 .
La hemoglobina animal puede ser fácilmente aislada en
forma tetramérica, conteniendo dos cadenas polipeptídicas
α-globina y dos β-globina. Cada monómero de globina posee
un grupo prostético hem. La secuencia de aminoácidos de las
cadenas α y β globina son idénticas en 50%, indicando que los
dos genes que las codifican son descendientes de un ancestro
común, 450 millones de años atrás. Estudios posteriores26-28
Cuadro1
Hemoglobinas humanas
Nominación Composición Proporción
adultos (%) neonatos (%)
HbA α2β2 97 20
HbA2 α2δ2 2.5 0.5
HbF α2γ2 <1 80
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Colombia Médica Vol. 36 Nº 3, 2005 (Julio-Septiembre)
encontraron hemoglobinas en diferentes invertebrados: artrópodos,
anélidos y nemátodos. Estas hemoglobinas están
relacionadas claramente con las hemoglobinas de los
vertebrados en cuanto a su estructura primaria, lo que sugiere
un gen ancestral común para vertebrados e invertebrados, de
670 millones de años29.
Las plantas utilizan la hemoglobina para unir y transferir
oxígeno a las mitocondrias durante la respiración. Fue descubierta
en los nódulos de las raíces de las legumbres30. Estos
nódulos representan una actividad simbiótica con bacterias
Rhizobium que permiten la fijación (reducción) del nitrógeno
atmosférico para la eventual síntesis de aminoácidos para la
planta. Este proceso requiere grandes cantidades de energía;
los nódulos contienen una abundante hemoglobina denominada
leghemoglobina, que facilita la difusión de oxígeno a la
cadena respiratoria bacteriana. Además, constituye un mecanismo
de secuestro de oxígeno, que mantiene al sistema
reductor de nitrógeno libre de oxígeno, el cual es lesivo para
dicha maquinaria. Aunque la secuencia de aminoácidos de las
leghemoglobinas difiere en 80% de las hemoglobinas de los
vertebrados, sus estructuras tridimensionales son idénticas.
El descubrimiento de hemoglobinas en una gran variedad
de plantas soporta el modelo de la leghemoglobina como un
producto especializado de un gen común propio de las plantas,
que codifica para hemoglobina. La presencia de hemoglobinas,
distintas a la leghemoglobina, en plantas no leguminosas
(Parasponia andersonni) está relacionada también con la
fijación simbiótica de nitrógeno. Sin embargo, estudios posteriores
demostraron la existencia de hemoglobina extranodular
con funciones no simbióticas, posiblemente relacionadas con
el transporte de O2 en la planta Trema tomentosa31. Se
describen entonces dos tipos de hemoglobinas en las plantas:
simbióticas y no simbióticas, codificadas por un gen ancestral
y al parecer común con el gen animal32 1500 millones de años
atrás.
Varios estudios confirman que el gen de la hemoglobina
Figura 3. Evolución del gen de la hemoglobina (ma: millones de años)
222
Colombia Médica Vol. 36 Nº 3, 2005 (Julio-Septiembre)
es verdaderamente ancestral y precede a la divergencia de
procariotas y eucariotas. Dicho gen se encuentra en
protozoarios como la Tetrahymenea y el Paramecium, así
como en las algas Chlamydomonas. Ha sufrido a lo largo de
la evolución modificaciones diferenciales en sus intrones pero
ha conservado la función de codificar una proteína que
transporta y libera O2. La levadura Saccharomyces presenta
una flavohemoglobina al parecer relacionada con funciones
de regulación y señalización celular33. El nemátodo Ascaris
suum, posee una hemoglobina que cataliza la desoxigenación
dependiente de óxido nítrico, manteniendo plenamente la
oxidación mitocondrial anaeróbica a nivel intestinal34. De la
misma forma, se han encontrado hemoglobinas en muchas
bacterias entre las que se incluyen Escherichia coli,
Alcaligenes eutrophus, Vitreoscilla, Nostroc commune,
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis,
entre otras, donde cumplen funciones como la catálisis de
reacciones redox, el transporte y liberación de O2 y el
metabolismo del óxido nítrico.
NUEVAS GLOBINAS
Recientemente se ha descubierto, en las secuencias de
ADN complementario, un tercer tipo de globina en ratones y
en humanos denominada neuroglobina (NGB)35. El gen
codifica en ambas especies, una proteína de 151 aminoácidos
(masa molecular de 17,000). Dicha proteína es en 94% similar
entre el ratón y el hombre, mientras que la similitud de ésta con
la Hb y la mioglobina humana es de tan sólo 25% y 21%
respectivamente. Lo anterior sugiere que es una proteína
altamente conservada a través de la evolución (670 millones
de años aproximadamente) y que, aunque hace parte de la
superfamilia de las globinas, tiene una función diferente. Se
demostró espectroscópicamente, que la NGB es la primera
hemoglobina hexacoordinada caracterizada en vertebrados36.
La hexacoordinación es un mecanismo que regula la unión del
ligando con las proteínas hémicas, a través de la competición
entre un ligando externo y uno interno por una cadena de
aminoácidos (histidina distal). Con base en lo anterior se
sugieren diversas funciones de la NGB: como transportador
de O2 y facilitador de su difusión a la mitocondria; como
enzima, facilitando la generación glicolítica de ATP; como
sensor de O2; y como detoxificador de óxido nítrico37-40.
El análisis del patrón de expresión en diferentes tejidos
resalta una mayor presencia de NGB en el cerebro, sobre
todo en el lóbulo frontal, el núcleo subtalámico y el tálamo
(Cuadro 2). La concentración de esta proteína en el cerebro
del ratón es menor a 0.01% del contenido proteico total. La
NGB se expresa como un monómero que une reversiblemente
O2. Su espectro de absorción tiene tres picos en 424, 528 y 558
nm en la forma desoxi-NGB, y un solo pico en 413 nm como
oxi-NGB. Aunque los picos en el ultravioleta son similares a
los de otras globinas, el espectro visible es inusual, e indica la
presencia de un grupo hem de bajo spin, como el observado
en las fibras nerviosas del molusco Spisula solidissima. La
NGB recombinante tiene una afinidad por el O2 de 1.9 a 2.3
torr, muy superior a la de la Hb de mamíferos (27 torr), pero
inferior a la de la mioglobina (1 torr). El gen de la NGB está
ubicado en 14q24. posee tres intrones en las posiciones B12-
2 (hélice B, aminoácido 12, codón 2), E11-0 y G7-0. Los
intrones B12-2 y G7-0 se conservan en las hemoglobinas y
mioglobinas de los vertebrados y de otras familias taxonómicas.
El intrón central, E11-0, puede representar un caso de
adquisición independiente de un intrón.
La presencia de un tercer tipo de globina, constituye un
importante modelo para el estudio de la evolución de las
especies. Adicionalmente, constituye una proteína especializada
en incrementar la presión de O2 en tejidos específicos,
diferentes al músculo. Sin embargo, se han observado globinas
en el sistema nervioso de subfamilias de invertebrados, como
anélidos, moluscos y nemátodos. Las propiedades de unión de
O2 de la NGB son semejantes a las de la mioglobina de los
vertebrados, lo que sugiere una función similar, pero a nivel
cerebral. A pesar de su baja concentración, la NGB puede
suplir de O2 al cerebro, atravesando la barrera hematoencefálica.
Al igual que la NGB, la citoglobina(Cygb) fue encontrada
en las bases de datos de ADN complementario del ratón y el
humano41. Los análisis filogenéticos sugieren que la Cygb y
la mioglobina forman un clan común dentro del árbol de las
globinas de los vertebrados. Estos genes se separaron hace
aproximadamente 450 millones de años. En este escenario
evolutivo, la mioglobina parece ser una especialización muscular
de una globina intracelular que tiene una amplia distribución
tisular y una función general. El gen de la Cygb se
Cuadro 2
Expresión tisular de NGB
Tejido cerebral Expresión (%) Otros tejidos Expresión (%)
Núcleo subtalámico 100 Hipófisis 62
Lóbulo frontal 73 Apéndice 25
Tálamo 73 Glándula adrenal 21
Polo occipital 70 Pulmón 19
Cerebro fetal 34 Colon 10
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Colombia Médica Vol. 36 Nº 3, 2005 (Julio-Septiembre)
encuentra en 17q25. La conservación de las secuencias entre
la Cygb de ratón y la humana es de 96%. Los residuos claves
en la estructura y función respiratoria de las globinas, PheCD1,
HisE7 e HisF8, están conservados en la Cygb. Además, esta
proteína pertenece a las hemoglobinas hexacoordinadas
recientemente descritas.
El papel fisiológico de las hemoglobinas pentacoordinadas
de los vertebrados está bien definido: el transporte de O2 por
la Hb y la difusión facilitada y el almacenamiento de O2 por la
mioglobina. Sin embargo, esta situación es menos clara para
las hemoglobinas hexacoordinadas. Al parecer, tanto la NGB
como la Cygb, comparten las mismas propiedades estructurales
y fisiológicas42.
OXIDACIÓN Y REDUCCIÓN
La oxihemoglobina en solución se autoxida y transforma
en metahemoglobina (metHb-Fe+3). Sin embargo, para lograr
la fijación reversible del O2, el hierro del hem debe
mantenerse en estado reducido (Ferroso, Fe+2) a pesar de la
exposición a diversos oxidantes endógenos o exógenos. Entre
estos se encuentran ciertos medicamentos oxidantes y algunas
toxinas. Para evitar la inactivación funcional de la Hb, el
eritrocito cuenta con una eficiente maquinaria reductora.
La oxidación de la Hb es escalonada. Los compuestos
intermedios se denominan híbridos de valencia y son el
resultado de la liberación de O2 molecular por parte de la
oxiHb que termina generando aniones superóxido o peróxido
que oxidan entonces el hierro Fe+2 a Fe+3. Normalmente se
genera 0.5% a 3% de metHb al día43.
A medida que la desnaturalización progresa, la metHb se
convierte en hemicromos. Estos aparecen cuando la sexta
posición de coordinación del hierro se une de manera covalente
con un ligando en la molécula de Hb (histidina distal-E7), lo
que distorsiona la estructura terciaria. Los hemicromos pueden
ser reversibles o irreversibles dependiendo del grado de
distorsión de la molécula de Hb y la capacidad potencial de la
enzima metahemoglobina reductasa de reducirlos. Cuando
los fenómenos oxidativos facilitan la disrupción de los contactos
α1β2, se produce la disociación de las cadenas polipeptídicas
en dímeros y monómeros que precipitan y constituyen las
inclusiones cocoides intraeritrocitarias denominadas cuerpos
de Heinz, que se unen a la membrana y acortan la vida del
glóbulo rojo1.
La reducción de la metHb se produce básicamente por
acción de la enzima citocromo b metahemoglobina reductasa
(67% de participación), que opera en presencia de dos
portadores de electrones, el citocromo b y el NADH+H. La
reducción también se produce por otros agentes como el
ácido ascórbico (16%), el glutatión (12%) y la enzima
NADPH-flavina reductasa (5%). Las pruebas in vitro
demuestran que la metahemoglobina reductasa es el factor
limitante de la reducción de metHb. El gen se localiza en el
cromosoma 2244 y su deficiencia se asocia clínicamente con
metahemoglobinemia45.
A medida que el O2 sufre reducciones univalentes, se
generan especies reactivas que constituyen los oxidantes
responsables de la desnaturalización, no sólo de la Hb, sino de
los demás componentes eritrocitarios, tales como los lípidos
de la membrana, lo cual conduce a lisis celular46. Entre estos
derivados están los aniones superóxido, peróxido y los radicales
hidroxilo. Para evitar en alguna medida este daño oxidativo,
el organismo cuenta con ciertos mecanismos que impiden la
acumulación de estas toxinas; algunos se ubican dentro de los
eritrocitos. Dentro de estos se encuentran: la superóxido
dismutasa, que cataliza la dismutación del superóxido a
oxígeno molecular y peróxido; la catalasa, que separa al
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular. Además
interactúa con la membrana en forma dependiente del Ca+2
y el pH y funciona como un reservorio de NADPH47, y
finalmente, la glutatión peroxidasa, principal selenoproteína
del organismo (hecho que explica posiblemente las propiedades
antioxidantes de este micronutriente)48, que cataliza la
conversión de peróxido a agua, oxidando el glutatión. La
alteración genética de la glutatión peroxidasa provoca anemia
hemolítica inducida por medicamentos. El glutatión es el
cofactor fundamental de la glutatión peroxidasa. Constituye
además el principal agente reductor de los eritrocitos y su
síntesis requiere de dos reacciones:
1. Ácido glutámico + cisteína γ-glutamil-cisteína
2. γ-glutamil-cisteína + glicina GSH
La primera reacción está catalizada por la glutamilcisteína
sintetasa y la segunda por la glutatión sintetasa49. El
proceso que evita la oxidación de la Hb requiere la oxidación
del glutatión reducido (GSH) a glutatión oxidado (GSSG).
Para ello es necesario un sistema que mantenga un suministro
continuo de GSH. Este sistema está representado por la
glutatión reductasa, que cataliza la reducción de GSSG a
GSH, con la participación del NADPH, producido en la vía de
las pentosas fosfato. Cualquier alteración en alguna parte de
esta vía de síntesis del GSH conduce eventualmente a
hemólisis.
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Colombia Médica Vol. 36 Nº 3, 2005 (Julio-Septiembre)
HEMOGLOBINA Y ÓXIDO NÍTRICO (NO)
El óxido nítrico es un mensajero biológico que participa en
la neurotransmisión, en la regulación vascular y en la respuesta
inmune. Es producido por muchos tipos de células como las
neuronas, el endotelio, las células musculares lisas vasculares
y los macrófagos. Reacciona con la desoxiHb y la oxiHb para
formar nitrosilHb (HbNO) y metHb más nitrato, respectivamente.
Las constantes de estas reacciones están en el orden
de 3-5 x107M-1·S-1, que significa una vida media de 1 μseg
para el NO. Con esta vida tan corta, la concentración de NO
no sería suficiente para activar a la guanilato ciclasa y no
produciría sus conocidos efectos de vasodilatación. Además,
la Hb libre se ha presentado como un «barrendero» muy
eficiente de NO, lo que disminuye aún más la biodisponibilidad
de este mensajero. Sin embargo, normalmente la Hb está
encapsulada en los eritrocitos, permitiendo preservar la función
de la molécula de NO por varios mecanismos fisiológicos
aún no entendidos del todo.
Varias teorías intentan explicar este fenómeno. Una de
ellas, establece que el NO entra en el eritrocito uniéndose de
manera cooperativa al hem de la Hb, formando HbNO,
limitando entonces la formación de metHb50. Luego, la
HbNO transfiere el NO a los grupos tiol (-SH) de ß93Cys
para formar S-NitrosoHb (SNO-Hb). La S-nitrosilación de la
Hb ocurre sobre todo en la estructura R (alta tensión de O2
-pulmones-), mientras que la liberación del NO se produce en
la transición a la estructura T (bajas tensiones de O2 -
capilares-). Después, el NO se exporta, como un equivalente
de NO bioactivo (X-SNO), a la membrana del eritrocito a
través de una proteína de intercambio aniónico, la banda 3.
Así, el intercambio de grupos NO entre SNO-Hb y la
membrana eritrocitaria está gobernado por la tensión de O2
(PO2): los eritrocitos dilatan los vasos sanguíneos a bajas PO2,
siendo requerida la producción de nitroso-tioles (SNO) a nivel
de la membrana eritrocitaria51,52.
Se establece además que la bioactividad del NO se
preserva gracias a limitaciones en las interacciones entre el
NO y el eritrocito. Estas barreras incluyen: 1) la propia
membrana eritrocitaria53; 2) una capa libre de eritrocitos en
los vasos sanguíneos inducida por el flujo laminar de sangre54
y 3) el citoesqueleto eritrocitario55. De esta forma se logra que
el consumo de NO por parte del eritrocito sea aproximadamente
800 veces menor que el consumo por parte de la Hb
libre.
Finalmente, cabe anotar que aunque la hemoglobina es la
proteína mejor caracterizada en todos sus aspectos, y que se
ha consolidado como un modelo de estudio en bioquímica y
fisiología, todavía falta mucho por descubrir acerca de su
función y de sus interacciones con otras moléculas. Cuando
se alcance este conocimiento se podrán desarrollar o mejorar
nuevas estrategias terapéuticas, por ejemplo, los sustitutos de
la sangre en el campo de la medicina transfusional, la sobre
expresión de la chaperona de la hemoglobina en pacientes con
ß-talasemia y el uso terapéutico del NO y de las proteínas que
se expresan en condiciones de hipoxia-isquemia.
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